Stefan Wilkening absolvierte an der Otto-Falckenberg-Schule in München seine Schauspielausbildung. Nach Engagements an den Münchner Kammerspielen und am Schauspiel Frankfurt war er von 2000 bis 2011 Ensemblemitglied am Bayerischen Staatsschauspiel. Seit 2011 ist er als freier Schauspieler, Sprecher und Moderator in zahlreichen Theater-, Hörfunk-, Hörbuch- und Filmproduktionen tätig. Er arbeitet sowohl mit großen Orchestern wie dem Rundfunkorchester des Bayerischen Rundfunks, den Münchner Philharmonikern oder den Düsseldorfer Symphonikern zusammen und tritt auch mit kleineren Besetzungen auf.
Seit mehr als 15 Jahren zählt Stefan Wilkening zu den prägenden Stimmen im Bayerischen Rundfunk. Sein Auftritt im Melodram Ariadne auf Naxos von Bender beim Mozartfest in Würzburg zählte zu einem der Höhepunkte des Festivals 2022.